Influência de diferentes sistemas e curvas de congelamento na congelabilidade e fertilidade do sêmen equino / Influence of systems and freezing curve in equine semen freezability and fertility

Avaliou-se o efeito de curvas de congelação nos parâmetros espermáticos e na fertilidade, usando sêmen de alta e baixa congelabilidade. Experimento 1 - utilizou-se sêmen de quatro garanhões resistentes à congelação: grupo 1, palhetas refrigeradas até 5°C e congeladas com curva de -8°C/min; grupos 2 e 3, palhetas refrigeradas até 5°C (0,5°C/min.) e congeladas com curvas de -20°C/min e -10°C/min, respectivamente. Experimentos 2 e 3 - utilizaram-se cinco garanhões (Mangalarga Marchador), respectivamente, de alta e baixa congelabilidade: grupo 4, a mesma metodologia descrita no grupo 1; grupos 5 e 6, palhetas refrigeradas até 5°C (0,5°C/min) e congeladas com curva de -20°C/min, entre 5°C e -60°C, e -10°C/min, entre -60°C e -100ºC (grupo 5), e -25°C/min, de 5°C até -100°C (grupo 6). O sêmen foi avaliado após descongelamento pelo método computadorizado. No experimento 1, não houve diferença nos parâmetros avaliados. No experimento 2, os parâmetros motilidade total (MT) e motilidade progressiva foram superiores aos do grupo 6 em relação ao grupo 4. No experimento 3, a MT foi superior no grupo 6 em relação ao grupo 4. As curvas de congelação mais rápidas apresentaram melhores parâmetros de cinética espermática, após a descongelação, para o sêmen de garanhões da raça Mangalarga Marchador.(AU)

The effect of freezing curves on sperm parameters and fertility, using resistant and sensitive semen to cryopreservation, was evaluated. In experiment 1, Semen from 4 stallions resistant to freezing was used: Group 1, straws were cooled to 5°C and frozen with a curve of - 8°C/min; Groups 2 and 3, straws were cooled to 5°C (0.5°C/min) and frozen with curves of - 20°C / min and - 10°C/min, respectively. In experiments 2 and 3, 5 stallions (Mangalarga Marchador) presenting respectively resistant and sensitive sperm to cryopreservation were used: Group 4, same methodology described for Group 1 was performed; Groups 5 and 6, straws were cooled to 5°C (0.5°C/min) and frozen with a curve of - 20°C/min. between 5°C and - 60°C and -10°C/min. between - 60°C and - 100°C (Group 5) and - 25°C/min. 5°C to - 100°C (Group 6). Thawed-semen was evaluated by the computerized method CASA. In Experiment 1, there was no difference in the evaluated parameters. In Experiment 2, total motility (MT) and progressive motility (PM) were higher in Group 6 compared to Group 4. In Experiment 3, TM was higher in Group 6 than Group 4. The faster freezing curves showed better parameters of sperm kinetics after thawing, for the Mangalarga Marchador stallion semen.(AU)

Óleo de peixe associado ao ácido ascórbico no diluidor para criopreservação de sêmen caprino / Fish oil associated to ascorbic acid in diluter for cryopreservation goat semen

O presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito da inclusão de óleo de peixe associado ao ácido ascórbico no diluidor para criopreservação de sêmen caprino. Dois machos da raça Boer foram submetidos à coleta de sêmen pelo método de vagina artificial, sendo os ejaculados avaliados quanto aos aspectos físicos e morfológicos. Após avaliação, formou-se um pool, seguido do fracionamento em cinco grupos: G1 - diluidor citrato-gema e G2, G3, G4 e G5 - diluidor citrato-gema acrescido de 1,0; 2,0; 3,0 e 4,0% de óleo de peixe e 0,05% de ácido ascórbico, respectivamente. Após descongelamento, foram realizadas avaliações físicas do sêmen e os testes complementares de termorresistência lento (TTR), hiposmótico (HO), integridade acrossomal e compactação da cromatina espermática. Houve comportamento linear crescente (P<0,05) para motilidade pós-descongelamento. Não houve diferença (P>0,05) para vigor pós-descongelamento (2,00±0,24). No TTR não houve diferença (P>0,05) para motilidade e vigor espermáticos entre os tempos cinco e 180min, com médias inicial e final de 62,17±12,13 e 14,29±10,55 para motilidade e de 2,00±0,52 e 0,49±0,44 para vigor. Não houve diferença (P>0,05) para o HO, com porcentagem média de espermatozoides reativos de 23,5±5,96%. Houve comportamento linear crescente para acrossoma íntegro e decrescente para acrossoma irregular (P<0,05). Não houve diferença (P>0,05) na compactação da cromatina, com 97,06±1,17% de cromatina íntegra. A inclusão até 4% de óleo de peixe acrescido de ácido ascórbico no diluidor melhorou motilidade e integridade de acrossoma após a criopreservação.(AU)

The study aimed to evaluate the effect of fish oil inclusion associated with ascorbic acid in the thinner for goat semen cryopreservation. Two male Boers underwent semen collection through the artificial vagina method, ejaculates being then assessed for physical and morphological aspects. After evaluation, a pool was formed, followed by the split into five groups: G1 - yolk-citrate extender and G2, G3, G4 and G5 - yolk-citrate extender plus 1.0; 2.0; 3.0 and 4.0% fish oil and 0.05% ascorbic acid, respectively. After thawing, physical evaluations of semen were assessed and additional testing slow heat resistance (TTR), hiposmotic (HO), acrosome integrity and compression of sperm chromatin. There was linear increase (P<0.05) post-thaw motility. No difference was obtained for post-thaw vigor and there was no influence of the association of fish oil and ascorbic acid in TTR. Plasma membrane integrity, by hyposmotic test (HO), presented a mean of reactive spermatozoa of 23.5±5.96% (P>0.05). There was linear increase for intact acrosome and decreasing acrosome irregular (P<0.05). In the analysis of the chromatin compaction, approximately 3% of damages (P>0.05) were observed. The inclusion of 4% fish oil plus ascorbic acid in diluter improved motility and acrosome integrity after cryopreservation.(AU)

Dois diluentes comerciais na criopreservação de espermatozoides do epidídimo de touros / Two commercial extenders for cryopreservation of epididymal bull sperm

A recuperação e a criopreservação de espermatozoides do epidídimo constituem alternativas viáveis para a preservação de material genético de animais valiosos. O objetivo deste estudo foi comparar o desempenho de dois diluentes comerciais Botu-Bov(r) (BB) e Bovimix(r) (BV), sobre a viabilidade pós-descongelação de espermatozoides do epidídimo de touros Tabapuã (Bos taurus indicus) pós-castração. Os espermatozoides foram colhidos da cauda de 20 epidídimos utilizando a técnica de fluxo retrógrado, centrifugados e diluídos com BB ou BV para posterior criopreservação a -196°C. Após a descongelação, as amostras foram avaliadas utilizando a análise computadorizada (CASA) e por análises microscópicas para a determinação da integridade de membranas plasmáticas, acrossomal e morfologia espermática. A avaliação estatística dos dados foi realizada pela análise de variância (ANOVA) com o pós-teste de comparações múltiplas de Tukey-Kramer, com nível de significância (P<0,05). Os resultados do movimento espermático avaliado pelo CASA, não diferiram para o diluente BB e BV. Também não foi observada diferença significativa entre os grupos no percentual de espermatozoides morfologicamente deformados, defeitos de acrossoma e espermatozoides com membrana plasmática íntegra após o descongelamento. Conclui-se que ambos os diluentes (BB e BV) são eficientes e podem ser utilizados na tecnologia do congelamento de espermatozoides colhidos da cauda do epidídimo de touros, não apresentando diferença na viabilidade espermática para os parâmetros estudados.

Recovery and cryopreservation of epididymal sperm is a viable alternative for preservation of genetically valuable animals. The aim of this study was to verify and to compare the effect of two commercial extenders for conventional semen on post-thawing viability of bovine epididymal sperm. For this purpose, the spermatozoa was recovered from the tail of 20 epididymis of Tabapuã bulls (Bos Taurus indicus) using retrograde flow method. After sperm recovery, the cells were centrifuged and divided for dilution with the diluents Botu-Bov(r) (BB) or Bovimix(r) (BV) for cryopreservation at -196°C. After thawing, all samples were evaluated using computer assisted sperm analysis (CASA), and by microscopic analysis for determination of integrity of plasma and acrossomal membrane and morphology. Statistical evaluation was performed by analysis of variance (ANOVA) with post-test for multiple comparisons, the Tukey-Kramer test, with significance level (P<0.05). The results of the sperm movement for diluent BB and BV evaluated with CASA, showed no difference for both (P>0.05). There was also no difference between the percentage of deformed sperm, acrosome defects and the sperm with intact plasma membrane after thawing with BB or BV. We conclude that both extenders (BB and BV) are efficient and can be used for freezing sperm collected from the epididymis of bulls, showing no difference for all the parameters studied.

Cooling of ejaculated and epididymal stallion sperm / Refrigeração de espermatozoides do ejaculado e epidídimo em garanhões

After a serious injury or sudden death, epididymis cauda sperm recovery and cryopreservation may present as the last opportunity to obtain genetic material from a valuable stallion. This study evaluated the viability of cooled equine sperm collected by three different methods: sperm of ejaculated (G1), sperm recovered from the epididymal cauda immediately after orchiectomy (G2) and sperm recovered from the epididymal cauda after storage for 24 hours at 5°C (G3). To obtain G1 sperm, two ejaculates were collected. After 1 week, all stallions underwent a bilateral orchiectomy, and one of the removed epididymides was flushed to obtain G2 sperm. The contralateral epididymis was stored at 5°C for 24 hours before being flushed to obtain G3 sperm. The sperm samples were evaluated immediately after the addition of the refrigeration extender, and after 24 and 48 hours of storage at 5°C. After 24 and 48 hours of storage, the epididymal sperm demonstrated higher motility traits when compared to the ejaculated sperm (P<0.05). These results indicate that sperm recovered from the epididymal cauda of stallions are more resistant to the cooling process, with higher kinetic parameters and plasma membrane integrity when compared to the ejaculated sperm.

A recuperação de espermatozoides da cauda do epidídimo pode ser a última chance para preservação do germoplasma quando ocorre morte súbita ou lesão grave em garanhões de alto valor genético. O presente trabalho comparou a viabilidade após refrigeração dos espermatozoides do ejaculado (G1), recuperados da cauda do epidídimo imediatamente após a orquiectomia (G2) e recuperados após armazenamento do epidídimo por 24 horas a 5ºC (G3). No G1 foram colhidos dois ejaculados. Uma semana após a colheita dos ejaculados os garanhões foram submetidos à orquiectomia bilateral e realizada a colheita dos espermatozoides da cauda do epidídimo de um testículo de cada garanhão (G2). O testículo contralateral permaneceu a 5°C por 24 horas, antes da recuperação espermática (G3). A análise das amostras foi realizada imediatamente após a adição do meio de refrigeração, e após 24 e 48 horas de armazenamento a 5°C. Após 24 e 48 horas de armazenamento, os espermatozoides do epidídimo demonstraram características de cinética maiores que os do ejaculado (P<0.05). Estes resultados indicam que espermatozoides recuperados da cauda do epidídimo foram mais resistentes ao processo de refrigeração, com maiores parâmetros de cinética espermática e integridade da membrana plasmática quando comparados aos espermatozoides do ejaculado.

Espermatozoides caprinos criopreservados em meio à base de leite desnatado acrescido de glutationa reduzida / Goat spermatozoa after freezing in skimmed-milk extender supplemented with reduced glutathione

Visando avaliar o efeito da adição de glutationa reduzida (GSH) ao diluente de congelação de sêmen caprino à base de leite desnatado, utilizou-se sêmen de cinco reprodutores Boer. Após colheita e avaliação, procedeu-se à formação do pool dos ejaculados e diluição em leite desnatado e glicerol 7 por cento, acrescido de antioxidantes: G1) Controle; G2) GSH 2mM mL-1; G3) GSH 5mM mL-1 e G4) GSH 7mM mL-1. As amostras foram congeladas em palhetas (0,25mL) e armazenadas a -196°C. Após descongelação, avaliou-se a integridade de membrana plasmática (iMP) e acrossomal (iAc), potencial de membrana mitocondrial (PMM), cinética e ultraestrutura. Os grupos Controle e GSH (2, 5 e 7mM mL-1) não diferiram (P>0,05) em iMP, iAc, PMM e cinética. Na análise ultraestrutural, os porcentuais de membrana plasmática (cabeça e cauda) e acrossoma íntegros não diferiram (P>0,05) entre grupos. Todavia, o grupo Controle apresentou maior porcentual (P<0,05) de gametas com axonema íntegros do que os de GSH (2, 5 e 7mM mL-1). Maior porcentagem (P<0,05) de espermatozoides com mitocôndrias íntegras foi observada no grupo Controle do que nos de GSH (5 e 7 mM mL-1). Conclui-se que a adição de GSH (2, 5 e 7mM mL-1) em diluente de congelação de sêmen caprino, à base de leite desnatado, não preserva a integridade dos espermatozoides.

Aiming to evaluate in vitro effect of different concentrations of glutathione reduced (GSH) in skimmed-milk and glycerol 7 percent it was used semen from five Boer bucks. After collect and evaluation, a pool of samples was diluted in skimmed-milk and glycerol 7 percent plus antioxidant: G1) Control; G2) GSH 2mM mL-1; G3) GSH 5mM mL-1 and G4) GSH 7mM mL-1. Samples were frozen in straws (0.25mL) and stored at -196°C. After thawing, samples were subjected to integrity of the plasma membrane (iMP) and acrosomal (iAc), mitochondrial membrane potential (MMP), kinematic and ultrastructure analysis. Control and GSH (2, 5 and 7mM mL-1) groups did no differ (P>0.05) in iMP, iAc, PMM and kinematic parameters. In the ultrastructural analysis, percentages of acrosome and plasma membrane (tail and head region) intact did not differ (P>0.05) between groups. However, Control group had higher percentage (P<0.05) of gametes with intact axonemes than those of GSH (2, 5 and 7mM mL-1) groups. Higher percentage (P<0.05) of sperms with intact mitochondrias were observed on Control group than those of GSH (5 and 7mM mL-1). It can be concluded that the GSH (2, 5 and 7mM mL-1) addition in skimmed-milk diluent to freeze goat semen did not preserve sperm integrity.

Adição de piruvato de sódio e trolox ao diluidor utilizado para congelação de sêmen de garanhões férteis e subférteis / Effect of pyruvate and trolox added to the extender used for freezing fertile and subfertile stallion semen

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do piruvato e trolox (forma solúvel da vitamina E) sobre a qualidade espermática pós-descongelamento. Assim, com o intuito de proteger as células espermáticas dos efeitos deletérios da criopreservação,foram considerados os seguintes tratamentos: T1 (Controle)= INRA82-HEPES sem antioxidantes; T2= INRA82-HEPES + 2mM de piruvato e T3= INRA82-HEPES + 120mM de trolox. As amostras de sêmen descongeladas foram avaliadas quanto à motilidade total (MT) e progressiva (MP), a integridades de membrana plasmática e acrossômica, integridade do DNA, à estabilidade de membrana e ao potencial de membrana mitocondrial (Δψm). A adiηγo de piruvato proporcionou resultados superiores (P<0,05) àqueles obtidos com trolox na motilidade espermática total (9,17 e 14,5 por cento, respectivamente). A adição de piruvato incrementa a motilidade espermática (18,92 e 19,0 por cento, respectivamente) em garanhões férteis e subférteis submetidos à congelação.

The objective of this research was to evaluate the effect of pyruvate and trolox on the thawed sperm quality. For freezing, antioxidants were added to INRA 82-HEPES extender to protect sperm from the deleterious effects of oxidative stress, according to the treatments: T1= INRA82-HEPES without antioxidants; T2= INRA82-HEPES + 2mM of pyruvate and T3= INRA82-HEPES + 120 mM de trolox. The thawed semen samples were evaluated according to the total (MT) and progressive (MP) motility, integrity of plasma and acrossomal membrane, DNA integrity, membrane stability and mitochondrial membrane potential (Δψm). It was observed that the addition of pyruvate resulted in a significantly higher total sperm motility (P<0.05) to those obtained with trolox (9.17 and 14.5 percent, respectively). It can be concluded that the addition of pyruvate improves sperm motility (18.92 and 19.0 percent, respectively) in samples from fertile and sub-fertile stallions submitted to freezing.